研究亮点
- 一期法（one-stage assay，OSA）可检测到腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）来源的凝血因子VIII（factor VIII，FVIII；FVIII-SQ）经凝血酶介导的激活增强，而发色底物法（chromogenic substrate assay，CSA）未能捕捉到这一变化。
- 在小鼠和人体临床试验受试者中，OSA测得的FVIII活性与止血功能及临床出血发生率的相关性更佳。
- AAV-FVIII-SQ的激活增强以及辅因子稳定性正常，提示其生化特性不同于重组FVIII-SQ，这可解释不同检测方法之间的差异。
- 上述结果支持在血友病A基因治疗患者的FVIII活性监测中优先采用OSA，以预测表型结局。
研究背景
血友病A（hemophilia A，HA）是一种由凝血因子VIII（FVIII）缺乏或功能异常所致的遗传性出血性疾病。准确测定FVIII活性对于评估疾病严重程度、指导治疗及监测疗效至关重要，尤其是在新兴基因治疗背景下。多数血友病A基因治疗试验采用腺相关病毒（AAV）介导递送去B结构域的FVIII-SQ变体，以恢复FVIII活性。然而，不同FVIII活性检测方法之间存在差异，给结果解释带来困难：在接受AAV-FVIII-SQ治疗的患者中，一期法（OSA）测得的活性水平通常比发色底物法（CSA）高1.5至2倍；而对于重组FVIII-SQ，两种方法的结果则更为一致。
这一差异提出了一个关键问题：在基因治疗后，哪种检测方法更能反映参与止血的功能性FVIII。鉴于凝血酶在激活FVIII并促进内源性tenase复合体形成中的核心作用，有必要阐明AAV来源FVIII的生化与功能行为，以优化临床监测并预测出血表型。
研究设计
本研究在临床前和临床两个层面分析了AAV-FVIII-SQ的功能。在血友病A小鼠模型中，研究者在有或无von Willebrand因子（VWF）条件下，分别使用OSA和CSA评估FVIII活性，以探讨检测差异的来源；同时还检测FVIII A2结构域稳定性及其在内源性tenase复合体中的辅因子功能，以刻画其生化特性。
与此同时，SPK-8011临床试验（N=23）受试者累计99患者年，接受了两种检测方法的FVIII活性测定，并监测年化出血率（annualized bleeding rate，ABR）。研究采用负二项回归分析，以评估哪种检测方法更能预测临床表型；此外，还比较了重组FVIII-SQ与AAV-FVIII-SQ之间的差异。
主要结果
研究结果清楚表明，与重组形式相比，AAV来源FVIII-SQ的生化行为发生了改变。在小鼠和人类样本中，OSA一贯测得高于CSA的FVIII活性，这反映出AAV-FVIII-SQ经凝血酶介导的激活增强，而CSA未能检测到这一现象。即使在VWF敲除小鼠中，这种激活增强仍然存在，说明其与VWF相互作用无关。
AAV来源FVIII-SQ中对FVIII活性持续时间至关重要的A2结构域稳定性保持正常，提示其在内源性tenase复合体中的辅因子功能得以保留。小鼠功能实验显示，OSA相关的活性测定结果与实际止血功能高度一致，验证了OSA作为基因治疗来源FVIII活性更敏感指标的价值。
在临床上，对SPK-8011队列进行负二项回归建模显示，采用OSA而非CSA测量结果时，对出血结局（年化出血率）的预测呈更佳趋势。这提示OSA对凝血酶激活后FVIII活性的增强检出，能够更准确地反映患者出血风险及治疗有效性。
专家点评
这些发现挑战了长期以来对CSA用于FVIII活性监测的传统依赖，尤其是在基因治疗背景下。AAV-FVIII-SQ对凝血酶激活的增强——可能源于AAV表达系统诱导的细微构象变化或翻译后修饰——可能赋予其不同的功能特性，因此需要结合具体检测方法进行解读。
临床医生和实验室专业人员应充分认识到CSA在基因治疗患者中的局限性，并优先采用OSA进行FVIII活性定量。尽管OSA对重组FVIII的高估程度可能较小，但其对治疗性FVIII变体临床相关激活状态的捕捉更为准确，对临床决策和出血风险评估更具参考价值。
本研究的局限性包括人群样本量相对较小，以及仍需在更多不同AAV基因治疗方案中进一步验证。未来研究应进一步探索导致凝血酶激活差异及检测相互作用的分子机制，并比较不同FVIII构建体的表现。
结论
本研究表明，与CSA相比，OSA测得的FVIII活性更能准确反映AAV来源FVIII-SQ经凝血酶介导的增强激活及其在内源性tenase复合体中的功能。因此，OSA可作为血友病A基因治疗患者临床出血表型更优的预测指标。将OSA纳入常规临床监测流程，有助于提高对基因治疗疗效的评估，并支持个体化管理。
这些结果强调，检测方法的选择应与新型治疗药物的生化特征相匹配，并支持在血友病基因治疗临床照护中进一步推进标准化与验证工作。
资助与ClinicalTrials.gov
SPK-8011临床试验由Spark Therapeutics资助。详细研究信息已注册于ClinicalTrials.gov。原始发表中未提供具体基金编号。
参考文献
- Sternberg AR, et al. One-stage assay factor VIII activity reflects AAV-derived factor VIII-enhanced thrombin activation and predicts phenotype. Blood. 2026;148(14):1848-1853. PMID: 42371804.
- Oldenburg J, et al. Standardization of Factor VIII and Factor IX Assays for Hemophilia Gene Therapy: Current Challenges. J Thromb Haemost. 2021;19(9):2183-2192.
- Pipe SW. Progress and Challenges in Hemophilia Gene Therapy. Blood. 2023;141(6): 589-599.
